悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.008

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (8): 1333-1340.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.008

悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体

张蕾^1，2，王宵燕¹，左其生¹，路镇宇¹，王飞¹，纪艳芹¹，王颖洁¹，张亚妮^1*，李碧春^1*

（1.扬州大学动物科学与技术学院江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300）

收稿日期:2014-12-11 出版日期:2015-08-23 发布日期:2015-08-23
通讯作者: 张亚妮，讲师，博士，主要从事动物遗传工程研究；李碧春，教授，博士，主要从事动物胚胎工程与遗传工程研究，E-mail：yubcli@yzu.edu.cn
作者简介:张蕾（1987-），女，江苏常州人，博士，主要从事胚胎干细胞体外诱导研究，E-mail：leizhang17@sina.com
基金资助:
国家自然科学基金(31272429；31472087)；江苏省研究生科研创新基金(CXZZ13_0909)

Embryoid Body Formation from Chicken Embryonic Stem Cells through Suspension Culture

ZHANG Lei^1，2，WANG Xiao-yan¹，ZUO Qi-sheng¹，LU Zhen-yu¹，WANG Fei¹，JI Yan-qin¹，WANG Ying-jie¹，ZHANG Ya-ni^1* ，LI Bi-chun^1*

（1.Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province，College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China）

Received:2014-12-11 Online:2015-08-23 Published:2015-08-23

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在通过悬浮培养法培养鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)，摸索鸡胚胎干细胞形成类胚体（Embryoid body，EB）的最佳方案，以期提高鸡胚胎干细胞体外诱导效率。将鸡ESCs培养传代至第3代，采用1×10⁴、3×10⁴和6×10⁴ mL^-13个细胞浓度，使用悬滴培养后，观察类胚体的形成效率。对悬滴培养形成的类胚体进行形态学观察，qRT-PCR检测干细胞标记基因的表达，免疫细胞化学检测相关蛋白的表达，并进行类胚体自分化检测和核型分析。3×10⁴ mL^-1细胞浓度生成的类胚体数量最高，单个视野下可观察到约267个类胚体，且形成的类胚体大小均一，呈圆球状。qRT-PCR检测结果表明，在类胚体形成48 h内，干细胞标记基因Nanog、Sox2、Oct4和C-kit仍维持表达。免疫细胞化学检测显示，该方法形成的类胚体表面抗原检测Nanog和SSEA-1呈阳性。自分化检测三胚层分化标记基因SOX17、SMA和TUJ-1呈阳性。核型分析显示，悬滴培养形成的类胚体具有并保持正常的核型。鸡ESCs悬滴培养形成类胚体的适宜细胞浓度为3×10⁴ mL^-1，且形成的类胚体可分化成3个胚层，用于体外定向诱导过程。本研究建立了鸡ESCs体外悬滴培养形成类胚体的培养体系，为后期信号通路的体外验证提供试验基础。

Abstract:

This experiment was conducted to explore the best suspension culture system for embryoid body (EB) formation from chicken embryonic stem cells (ESCs)，and to improve the induction efficiency of chicken ESCs in vitro.Pure clones from the third generation of chicken ESCs was collected，re-suspensed the cells into 3 cell concentrations：1×10⁴，3×10⁴and 6×10⁴ mL^-1 to make suspension culture.Morphology changes of EB were observed，qRT-PCR and immunofluorescence methods were used to detect the marker genes’s expression，self-differentiation and karyotype analysis were made to make full test of EB.The results showed that,the amount of EB with 3×10⁴mL^-1 cell concentration was higher than the other groups，and the number of EB reached 267 in one single view with the same spherical shape.The stem cell marker genes Nanog,Sox2,Oct4 and C-kit remained expression with 48 h of EB formation，and stem cell surface specific antigen (Nanog and SSEA-1) detection was positive.After self-differentiation of EB，3 embryonic germ layers specific antigen (SOX17, SMA and TUJ-1) detection all showed positive.Karyotype analysis showed that the formatted EB maintained normal karyotype.The results indicated that the suitable concentration for chicken ESCs form the EB through suspension culture was 3×10⁴ mL^-1，and the formatted EB had viability to provide experimental foundation for chicken ESCs induction in vitro.

中图分类号:

S831.2

张蕾，王宵燕，左其生，路镇宇，王飞，纪艳芹，王颖洁，张亚妮，李碧春. 悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(8): 1333-1340.

ZHANG Lei，WANG Xiao-yan，ZUO Qi-sheng，LU Zhen-yu，WANG Fei，JI Yan-qin，WANG Ying-jie，ZHANG Ya-ni，LI Bi-chun. Embryoid Body Formation from Chicken Embryonic Stem Cells through Suspension Culture[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(8): 1333-1340.

0
/ / 推荐

导出引用管理器 EndNote|Reference Manager|ProCite|BibTeX|RefWorks

链接本文: https://www.xmsyxb.com/CN/10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.008

https://www.xmsyxb.com/CN/Y2015/V46/I8/1333

参考文献

［1］SHARMA G T，DUBEY P K，VERMA O P，et al.Collagen-IV supported embryoid bodies formation and differentiation from buffalo (Bubalus bubalis) embryonic stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，424(3)：378-384.
［2］ITSKOVITZ-ELDOR J，SCHULDINER M，KARSENTI D，et al.Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers［J］.Mol Med，2000，6(2)：88.
［3］张良，黄冰，唐仕波，等.体外培养拟胚体条件的探讨［J］.中国病理生理杂志，2004，20(4)：700-702.
ZHANG L，HUANG B，TANG S B，et al.The explore of embryoid culture system in vitro［J］. Chinese Journal of Pathophysiology，2004，20(4)：700-702.（in Chinese）
［4］赵惠萍，王绮如.胚胎干细胞形成拟胚体的几个影响因素［J］.湖南医科大学学报，2003，28(1)：85-86.
ZHAO H P，WANG Q R.Influence factors of the formation of embryoid bodies［J］.Bulletin of Hunan Medical University，2003，28(1)：85-86.（in Chinese）
［5］RUNGARUNLERT S，TECHAKUMPHU M，PIRITY M K，et al.Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells：Benefits of bioreactors［J］. World J Stem Cells，2009，1(1)：11.
［6］陈明，毕琳琳，赵芳，等.拟胚体高密度培养促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化［J］.天津医药，2013，41(8):782-785.
CHEN M，BI L L，ZHAO F，et al.High density culture of embryoid bodies enhanced cardiac differentiation of murine embryonic stem cells［J］.Tianjin Medical Journal，2013，41(8):782-785.（in Chinese）
［7］彭红梅，陈贵安.人类胚胎干细胞体外分化形成包含多种细胞的类胚体［J］.北京大学学报：医学版，2005，36(6):605-608.
PENG H M，CHEN G A.Human embryonic stem cells forming embryoid bodies comprising multiple types of cells［J］.Journal of Peking University (Health Sciences)，2005，36(6):605-608.（in Chinese）
［8］陈惠芹，张绪超，黄绍良，等.BMP-4 与 VEGF 促进拟胚体中原始造血干细胞发生的实验研究［J］.中国实验血液学杂志，2008，16(4)：855-858.
CHEN H Q，ZHANG X C，HUANG S L，et al.BMP-4 and VEGF promote development of hematopoietic stem cells during the embryoid body formation from embryonic stem cells［J］.Journal of Experimental Hematology，2008，16(4)：855-858.（in Chinese）
［9］田孝祥，韩雅玲，康建，等.利用胚胎干细胞建立贴壁制备类胚体的新方法［J］.沈阳部队医药，2006，19(2):82-84.
TIAN X X，HAN Y L，KANG J，et al.A novel method for preparing embryoid bodies with attached embryonic stem cells［J］.Shenyang Military Medicine，2006，19(2):82-84.（in Chinese）
［10］刘卫生，王英杰，刘涛，等.模拟微重力条件下小鼠拟胚体形成及分化的初步观察［J］.第三军医大学学报，2008，30(17)：1594-1597.
LIU W S，WANG Y J，LIU T，et al.The formation and differentiation of mouse embryoid bodies under simulating microgravity［J］.Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 2008，30(17)：1594-1597.（in Chinese）
［11］孙敏，施青青，傅德智，等.鸡胚 ESC 和 SSCs 特定基因表达差异的研究［J］.生物技术，2011，21(3)：16-19.
SUN M，SHI Q Q，FU D Z，et al.Study of the expression of gene cell differentiation associated genes on chicken ESC and SSCs［J］.Biotechnology，2011，21(3)：16-19.（in Chinese）
［12］施青青，张振韬，李鹏程，等.BMP4 诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究［J］.畜牧兽医学报，2013，44(11)：1749-1757.
SHI Q Q，ZHANG Z T，LI P C，et al.Study on differentiation of chicken embryonic stem cells to male germ cells by BMP4［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2013，44(11)：1749-1757.（in Chinese）
［13］孙敏.鸡胚胎干细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备［D］.扬州：扬州大学，2012.
SUN M.Study on male germ cell derived from chicken embryonic stem cell and the generation of transgenic chicken［D］.Yangzhou:Yangzhou University,2012.（in Chinese）
［14］EYAL-GILADI H，KAYAK S.From cleavage to primitive streak formation：a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick：I.General morphology［J］.Dev Biol，1976，49:321-337.
［15］徐琪,陈国宏,张学余,等.3个地方鸡种的核型及其似近系数分析［J］.畜牧兽医学报，2004，35(4)：362-366.
XU Q，CHEN G H，ZHANG X Y，et al.Comparison on karyotype of three Chinese native chickens and their cluster analysis［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2004，35(4)：362-366.（in Chinese）
［16］TAKEDA A,ISHIZUKA T,GOTO T,et al.Polyembryoma of ovary producing alpha-fetoprotein and HCG：Immunoperoxidase and electron microscopic study［J］.Cancer,1982,49(9)：1878-1889.
［17］PIERCE G B,SPEERS W C.Tumors as caricatures of the process of tissue renewal：prospects for therapy by directing differentiation［J］.Cancer Res,1988,48(8)：1996-2004.
［18］MARTIN G R,EVANS M J.Multiple differentiation of clonal teratocarcinoma stem cells following embryoid body formation in vitro［J］.Cell,1975，6(4)：467-474.
［19］EVANS M J，KAUFMAN M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos［J］.Nature,1981,292(5819)：154-156.

[1]	唐鑫鑫, 郑炬梅, 骆娜, 营凡, 朱丹, 李森, 刘大伟, 安炳星, 文杰, 赵桂苹, 李和刚. 基于全基因组关联分析揭示肉鸡腿病发生的遗传机制[J]. 畜牧兽医学报, 2024, 55(1): 99-109.
[2]	徐小静, 董瑞玲, 魏立民, 赵少猛, 赵桂苹, 张敏红, 冯京海. 文昌鸡母鸡生长模型的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4952-4961.
[3]	齐丽娜, 陆雪林, 杨凯旋, 周瑾, 李先玉, 刘珂, 张文刚, 顾欣, 章伟建. 基于SNP芯片分析新浦东鸡的遗传多样性和遗传结构[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4962-4971.
[4]	王燕星, 张雨时, 姬海港, 刘阳, 牛玉芳, 韩瑞丽, 刘小军, 田亚东, 康相涛, 李转见. 鸡骨骼肌卫星细胞系的建立及分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4972-4981.
[5]	范晨宇, 单艳菊, 章明, 姬改革, 巨晓军, 屠云洁, 贺喜, 束婧婷, 刘一帆, 张海涵. 立华麻黄鸡体重和肉品质性状全基因组关联分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 4982-4992.
[6]	陈诚, 乔西波, 孙亿, 康丽, 姜运良. 琅琊鸡FSHR基因-868位点的多态性及对产蛋性能的遗传效应研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4560-4568.
[7]	金四华, 贾富民, 何培莉, 贾羽晴, 税斐, 刘旭玲, 刘星, 王新, 徐嫚, 耿照玉. IHH过表达对鸡原代软骨细胞增殖和分化的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4569-4576.
[8]	陈雪娇, 刘会杰, 臧蕾, 冯静, 鹏达, 张浩. 鸡胚心脏组织转录组数据鉴定雪域白鸡高原低氧适应性关键基因[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4154-4163.
[9]	张寅梁, 岳巧娴, 黄晨轩, 陈辉, 王德贺, 周荣艳. 产蛋初期和后期蛋鸡胫骨转录谱的构建及骨代谢相关基因分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4164-4173.
[10]	郑钢, 连玲. 鸡性别决定及分化关键调控基因DMRT1研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(8): 3152-3163.
[11]	白露, 王梦杰, 马小春, 何政肖, 谭晓冬, 刘杰, 赵桂苹, 文杰, 刘冉冉. 一种快速挖掘鸡品种特征性SNP标记集合的方法[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(8): 3252-3261.
[12]	陈春, 康昭风, 魏岳, 黎观红, 武艳平, 谢金防. Wnt3a基因多态性与崇仁麻鸡皮肤毛囊性状相关性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(7): 2810-2823.
[13]	刘航, 王欢欢, 葛莹, 张雷, 张伟武, 魏莹晖, 李庆海, 范京辉, 章学东. 基于转录组和蛋白组筛选乌骨鸡肤色性状候选基因[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2320-2329.
[14]	王辉, 许梦缘, 刘灵康, 郑喜邦, 李恭贺, 吴文德. PhiC31整合酶电穿孔鸡成纤维细胞诱发位点特异性基因盒交换[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2330-2342.
[15]	王政, 郭文婕, 程瑾, 原一桐, 罗榕, 薛毅, 张利环, 朱芷葳, 李慧锋. 营养转运相关基因调控区多态性与黄羽肉鸡饲料转化率关联分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(6): 2343-2352.

悬滴培养法促进鸡胚胎干细胞形成类胚体

Embryoid Body Formation from Chicken Embryonic Stem Cells through Suspension Culture

RichHTML

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价